低温贮藏冷冻生物实体的过程是在超低温(-196oC)同时保持细胞结构和功能的完整性。通过隔离供体细胞，低温保存有助于防止细胞培养的维持时间超过要求。因此，节约使用的培养基和塑料制品有助于削减成本。它进一步保护了由于多次传代而丢失的细胞的表观遗传特征。此外，它可以帮助利用同一批特定传代号的细胞进行多种用途，特别是当细胞有限或珍贵时。然而，与其他培养技术类似，整个冷冻保存过程的优化对于维持细胞活力和功能至关重要。
低温保存的主要考虑因素：
最佳冻结介质
冷冻培养基通常由冷冻保护剂、血清和培养基组成。冷冻保护剂通过溶于水来降低冰点，从而抑制冰晶的形成。这也降低了盐的浓度，否则会对细胞造成渗透压力。最常用的冷冻保护剂是DMSO溶液而且甘油与胎牛血清(FBS)一起使用。然而，对于临床应用，由于考虑到免疫原性，建议使用无血清和无异种培养基，并使用人白蛋白等替代品。最近的替代品是血小板裂解物和海藻糖。许多商业冷冻介质也有现成的，可能适用于特定的细胞类型。例如，像多能干细胞这样的敏感培养在血清存在的情况下倾向于分化，并且需要化学定义的商业成分进行冷冻。
冻结协议
虽然冷冻保存方案已经被广泛报道，但建议根据感兴趣的细胞类型优化冷冻方案，以最大限度地提高解冻后的活力和功能。
用于低温保存的冷冻速率
在长期储存前控制冷冻速率可以最大限度地提高细胞存活率。最佳的冷却速度必须是非常快速和非常缓慢的冷却之间的平衡，以防止脱水或冰结晶。缓慢冷却用冷冻保护剂代替细胞内的水含量，防止细胞损伤。另一方面，快速冷却使脱水率降到最低。冷冻容器通常确保冷却速率为-1oc /分钟。
解冻
解冻的速度和冷冻的速度一样重要，以获得最佳的细胞恢复。最好确保尽可能快的升温，以减少细胞暴露于细胞内盐的时间。最常见的做法是在37中解冻细胞oC水浴，可加上连续搅拌，使热梯度均匀。升温速率可由自动解冻系统控制。此外，通过离心和在无冷冻保护剂的介质中重悬，将冷冻保护剂从细胞中稀释出来是至关重要的。DMSO的存在即使是非常微小的量也会对细胞产生毒性，因此，rho激酶(ROCK)抑制剂可在解冻后加入培养基中以防止细胞凋亡。众所周知，蔗糖等添加剂可以通过细胞膨胀来提高复活率。这里的挑战是恢复解冻后细胞的生理过程。
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